Preguntas frecuentes

Para reservar, es necesario que primero se encuentre registrado en nuestra base de datos, para ello debe contactarse con la unidad de
microscopía.

Si, el cobro del uso de los equipos es necesario para financiar mantenciones, reparaciones, reemplazo de lámparas, upgrades e incluso
la compra de nuevo equipamiento.
Junto con lo anterior, el cobro por el uso de los equipos permite concientizar a los usuarios del cuidado que requieren estos sistemas,
así como expandir el uso de los equipos a usuarios externos la universidad.
Los valores de cobro de nuestros equipos se encuentran elaborados en base a las siguientes variables:

• Valor inicial del equipo
  Valor de mantención anual del equipo y anexos
• Valor de consumibles (lámparas, aceite de inmersión, papel)
  Gastos en infraestructura
  Gastos en asistencia técnica y personal

Te debes contactar con la unidad de microscopía indicando el equipo o servicio de tu interés.
Contamos con tarifas específicas para usuarios miembros de la comunidad UC, usuarios externos de otras Universidades y usuarios que
trabajan para empresas y otras instituciones con fines de lucro.

Si! Estamos para ayudarte. Completa nuestro formulario de entrenamiento en la pagina de reserva de horas con algunos detalles de tu
experimento y tu experiencia en microscopía. Usualmente respondemos en uno o dos días, y luego podemos coordinar una visita para
que hagas una prueba sin costo del equipamiento de acuerdo a la propuesta.

La adquisición de imágenes en célula viva requiere enfocarse tanto en el buen funcionamiento de las células durante el experimento,
como aplicar los métodos experimentales apropiados para seguir el proceso celular de interés. Aquí indicamos las condiciones
necesarias para mantener las células en estado nativo durante la adquisición de imágenes.

MEDIO DE CULTIVO
Los medios de cultivo deben estar formulados para mantener el crecimiento de las células sin compuestos que aumenten la
fluorescencia background, evitando el uso de rojo fenol. Cambien pueden utilizarse medios salinos para mejorar la calidad óptica, pero
estos no pueden usarse en estudios de larga duración que demanden alta actividad metabólica. El pH es critico para el crecimiento
eficiente de las células, por lo que debe mantenerse en el rango de 7-7.7

ATMÓSFERA
La adquisición de imágenes de células vivas en el microscopio usualmente requiere de cámaras de incubación, que permiten regular la
atmósfera y temperatura durante el experimento. En general, una concentración de 10-20mM de bufer HEPES puede controlar el pH en
ausencia de CO2, con bicarbonato de sodio para un crecimiento óptimo de las células.
Normalmente no es necesaria la regulación estricta de 02, en experimentos de célula viva. Muchas veces una atmósfera sin oxigeno es
usada como estrategia para reducir el fotodaño de la muestra (por reacciones con especies reactivas de oxigeno). Sin embargo en
algunas lineas celulares puede causar stress hipóxico.

OSMOLARIDAD
Debido a que las cámaras para covers en estudio de célula viva son muy pequeños, el medio está sujeto a cambios de osmolaridad por
la evaporación cuando se usan altas temperaturas. Es importante chequear el volumen del medio y sustituirlo para compensar la
evaporación. También se puede minimizar la evaporación usando cámaras selladas o con control de humedad.

Referencias

1. https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/imaging-basics/sample-considerations/live-cell-imaging.html
2. https://www.microscopyu.com/applications/live-cell-imaging/maintaining-live-cells-on-the-microscope-stage
3. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/live-cell-imaging/

Se debe incluir la siguiente información, que puede ser encontrada en las especificaciones técnicas de nuestros equipos:

• Modelo y marca del microscopio
• Información del lente objetivo utilizado: magnificación, apertura numérica (NA) y corrección (ej. 60x 1.4 NA Plan-Apochromat)
• Información del filtro de fluorescencia: marca y ancho de banda (ej. 490/30 nm)
• Fuente de luz (Mercurio, tungsteno, o laser) incluir longitud de onda
• Marca modelo de la cámara
• Software de adquisición, nombre y versión.
• Configuración de adquisición: tiempos de exposición, gain y binning. También el valor de Z en stacks (corte óptico), tiempo entre
• imágenes en timelapse.

También es recomendable incluir:

• Marca y modelo de hardware como ruedas de filtros, platinas motorizadas, shutters, etc.
• Descripción del protocolo de procesamiento de imágenes utilizado para generar las figuras de la publicación.
• Descripción del protocolo de cuantificación y análisis de imágenes y un método de validación.

[Extracto de Waters, J. C.(2009). Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of cell biology.]

Recuerde: “La mejor imagen es a que necesita un mínimo procesamiento”.

A continuación se detalla una breve guía ética para el uso y manipulación apropiado de imágenes científicas digitales:

• Las imágenes digitales científicas son datos y se deben tratar como tales, pudiéndose ver comprometidas por manipulaciones inapropiadas.
• La manipulación de imágenes digitales debe ser realizada solo en copias de los originales (Siempre guarde los datos originales a salvo y sin cambios!)
• Ajustes sencillos de brillo y contraste son aceptables si se aplica a toda a imagen.
• Recortar las imágenes es usualmente aceptable si no hay perdida de información.
• Imágenes digitales que serán comparadas entre si deben si ser adquiridas bajo las mismas condiciones, cualquier procesamiento post-adquisicion debe ser aplicado a ambas por igual.
• Manipulaciones especificas en ciertas áreas de una imagen, no aplicadas a la imagen completa, son cuestionables.
• El uso de filtros de software (Photoshop) para mejorar las imágenes no es recomendado.
• Clonar o copiar objetos en una imagen digital, ya sea de la misma imagen o de otra, es muy cuestionable.
• Mediciones de intensidad deben ser realizadas en imágenes que han sido procesadas uniformemente, y los datos deben ser calibrados de acuerdo a un standard conocido.
• Evite el uso de imágenes comprimidas, prefiera el formato original o TIFF.
• Tenga cuidado cuando cambie el tamaño de una imagen digital (en pixels), esto afecta su resolución.

Finalmente, recuerde que las importancia de las imágenes científicas radica en los datos que contienen, y no en su efecto estético.

[Extracto de Cromey, D. W. (2010). Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific
digital images. Science and engineering ethics.]

En la adquisición de imágenes de fluorescencia, el tiempo de exposición (Exposure en ingles), es el tiempo que el la cámara estará
expuesta a la luz emitida la por la muestra. A mayor tiempo de exposición, más fotones llegarán a la cámara, lo que resultará en una
imagen más brillante.

Una vez establecido el tiempo de exposición para un set de muestras a comparar, este valor no debe ser cambiado (a menos que se
tomen todas las imágenes nuevamente con el nuevo valor).

El tiempo de exposición se determina usando la muestra con a mayor señal esperada (la más brillante). Una vez seleccionada esta
muestra, se selecciona el tiempo de exposición más largo que permita utilizar todo el rango dinámico de la cámara, pero sin saturar los
pixeles.

Recuerde que tiempos de exposición excesivamente largos pueden dañar su muestra y blanquear la señal fluorescente
(photobleaching).

[Extracto de Exposure times by Thermo Fisher Scientific (2015), artículo disponible en www.thermofisher.com]

La exposición, ganancia (gain) y offset determinan la intensidad de señal y el nivel de ruido de una imagen digital, y son los parámetros
de configuración esenciales al momento de adquirir imágenes en microscopía de fluorescencia.

El tiempo de exposición (Exposure en la ingles), es el tiempo que la cámara estará expuesta a la luz emitida por la muestra. A mayor
tiempo de exposición, más fotones llegarán a la cámara, lo que resultará en una imagen más brillante. Si la señal fluorescente es lo
suficientemente brillante y la muestra tiene baja señal de background, se adquirirán imágenes con buen contraste.

La ganancia (Gain en ingles) amplifica digitalmente la señal recibida por la cámara, por lo tanto aumenta tanto la señal como el ruido
percibido. Cuanto menor sea la ganancia aplicada, mejor será la relación señal/ruido de nuestras imágenes.
El offset determina el valor de señal minimo detectado por la cámara, es decir, los valores bajo el offset son considerados como pixeles
negros (con intensidad cero). Mientras mayor sea el valor de offset, mas señal será “cortada”.

El histograma_es una representación grafica del uso del rango dinamico de la cámara, esto es, del rango de niveles de brillo que puede
captar la cámara. Lo ideal al adquirir una imagen digital es utilizar todo la el rango dinamico de la cámara, representado por un histograma
que se distribuya uniformemente desde el minimo hasta máximo valor.

Los parámetros de exposición, ganancia y offset deben ser configurados de una forma tal que no se pierda señal por pixeles saturados,
o por quedar bajo el valor la de offset. A la vez, esta configuración debe utilizar todo el rango dinámico disponible de la cámara.

Es importante que todas las imágenes de un set de muestras sean adquiridas con los mismo parámetros, sobre todo si serán utilizadas si
posteriormente para comparaciones cualitativas o análisis cuantitativos.

Las imágenes adquiridas con el software Zen Black (microscopios Zeiss) se pueden abrir en el programa gratuito Zen Lite. Las
imágenes adquiridas con el software NIS-Elements (microscopios Nikon) pueden ser visualizadas en el software libre NIS-Elements
Viewer.

Ambos formatos son compatibles con el software FIJI, también de libre acceso.
Los links de descarga de los programas ya nombrados son, respectivamente, los siguientes:

Link de descarga Zen Lite
Link de descarga NIS-Elements Viewer
Link de descarga FIJI

Por otro lado, las imágenes adquiridas con el software FV10-ASW (Microscopios Olympus) pueden ser abiertas también mediante FIJI.

Más información respecto a los formatos aceptados por FIJI se puede encontrar en el siguiente link:
formats supported by FIJI

Existen diversos programas para el análisis y procesamiento de imágenes, uno de ellos es FIJI. Este software de libre acceso es un
paquete completo de Image J que permite realizar distintas operaciones, tales como: segmentar, cuantificar, deconvolucionar, entre
otras funciones.

Alternativamente, existe una compilación del programa Image J denominado Confocal Uniovi ImageJ, el cual facilita el procesamiento
de imágenes confocales. Gracias a su interfaz gráfica, el software Confocal Uniovi ImageJ permite procesar imágenes tan sólo con
hacer clic en un botón, pues esta interfaz agrupa las principales funciones para el procesamiento de imágenes confocales y las
representa con botones. Este software de libre acceso puede ser descargado en la siguiente página:
Página para descargar ConfocalUniovi Image J